【Sanger测序原理与方法】在分子生物学的发展历程中，DNA测序技术一直扮演着至关重要的角色。其中，Sanger测序法作为最早被广泛应用的DNA测序技术，为现代基因组学奠定了坚实的基础。尽管随着高通量测序技术的兴起，Sanger测序的应用逐渐减少，但其在特定领域仍具有不可替代的价值。本文将围绕Sanger测序的基本原理与实验方法进行详细介绍。

一、Sanger测序的基本原理

Sanger测序法由英国科学家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）于1977年提出，因此得名。该方法的核心思想是利用链终止法（Chain Termination Method）来确定DNA序列。其基本原理是通过在DNA复制过程中引入一种特殊的核苷酸——双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），这些核苷酸在加入到新合成的DNA链后会阻止进一步的延伸，从而形成一系列长度不同的DNA片段。

具体来说，在反应体系中包含以下关键成分：

- 模板DNA：待测序的DNA片段。

- 引物：一段与模板DNA互补的短单链DNA，用于启动DNA合成。

- DNA聚合酶：催化DNA链的延伸。

- 四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）：A、T、C、G，用于正常链的延伸。

- 四种双脱氧核苷三磷酸（ddNTPs）：分别对应A、T、C、G，它们在掺入后会终止链的延伸。

在每个反应管中，只加入一种特定的ddNTP，这样在反应结束后，会得到一系列长度不同的DNA片段，每个片段的末端都带有特定的碱基。

二、Sanger测序的实验步骤

Sanger测序的具体操作流程可以分为以下几个步骤：

1. 制备反应体系

在四个独立的反应管中，分别加入相同的模板DNA、引物、DNA聚合酶和三种dNTP，同时在每个管中加入不同类型的ddNTP（如一个管中加入ddATP，另一个加入ddTTP等）。

2. DNA扩增与链终止

在PCR条件下进行反应，DNA聚合酶按照模板顺序合成新的链。当遇到ddNTP时，由于缺乏3'-OH基团，无法继续延伸，导致链终止。

3. 电泳分离产物

将四个反应体系中的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或毛细管电泳。由于每个片段的长度不同，它们在电场中迁移的速度也不同，最终形成一条条带。

4. 读取序列信息

通过观察电泳结果，从下到上依次读取每个片段的末端碱基，从而获得完整的DNA序列。

三、Sanger测序的优势与局限性

优势：

- 准确性高：Sanger测序的准确率可达99.9%，适用于小片段测序和验证性测序。

- 操作相对简单：相较于新一代测序技术，Sanger测序在实验条件和设备要求上较为宽松。

- 适合低通量应用：对于少量样本的测序需求，Sanger测序仍然是经济且可靠的选择。

局限性：

- 通量低：一次只能测序一个片段，难以满足大规模基因组测序的需求。

- 成本较高：每条序列的测序成本相对较高，不适合高通量项目。

- 长度限制：通常适用于500 bp以内的片段，长片段测序效率较低。

四、Sanger测序的实际应用

尽管高通量测序技术已经广泛应用于基因组研究，Sanger测序仍然在多个领域发挥重要作用：

- 基因克隆与验证：在构建重组质粒或克隆基因时，常用于确认插入片段的正确性。

- 临床诊断：在某些遗传病的检测中，Sanger测序仍是金标准。

- 突变分析：用于检测已知位点的点突变或小范围变异。

五、结语

Sanger测序虽然不是当前最先进的测序技术，但其在科学探索和技术发展中具有不可磨灭的历史意义。它不仅推动了人类基因组计划的完成，也为后续的基因组学研究提供了理论基础和技术支持。在未来的科研实践中，Sanger测序仍将在特定场景中发挥其独特价值。